相差显微镜概述

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注：我们常说的相衬显微镜,比较显微镜均指相差显微镜。

相差显微镜由P·Zernike（采尔尼克）于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理学奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色透明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。

相差显微镜的基本原理是：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：

1、环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

2、相位板（annular phase plate）：在物镜中加了镀有特殊膜层（如氟化镁、硫化锌与铬等）的相位板，可将直射光在规定的区域内通过，且被吸收掉大量的光能量，使直射光的振幅衰减至与衍射光振幅相当，同时改变某一个位相差，分为两种：

（1）A+相板：将衍射光的相位推迟1/4λ（90°），两组光波合轴后光波相加，振幅加大，当标本折射率大于周围介质时，标本图像比背景暗，反之，标本图像比背景图像亮。此时，相板环形部分仅起吸收直射光能量的作用，其余通光部分则起改变相位的作用（即改变衍射光的相位）。

（2）B+相板：将直射光推迟1/4λ（90°），两组光线合轴后光波相减，振幅变小，当标本折射率大于周围介质时，标本图像比背景亮，反之，标本图像比背景图像暗。同A+相板相比，主要是通过改变直射区域的膜层厚度来实现透射率与相位的改变，此时相板环形部分不仅起吸收直射光能量的作用，还改变直射光相位。

应用相衬显微镜要注意以下几个方面：

A．光源要强，全部开启孔径光阑；

B．使用滤色片，使光波近于单色。

相衬显微镜与暗视野显微镜均可以观察未染色的透明样品，但其成像照明原理是完全不同的，同后续的微分干涉观察法也有着本质的区别。