荧光显微镜如何激发荧光

荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。

荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。

荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源、滤片系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。

激发荧光的方式：按光的波长范围分为UV激发法（使用紫外线照明法）和BV激发法（使用蓝紫光）两种。UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。

BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。用于荧光抗体法的荧光色素。对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的图像。其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。

综上所述，荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑。

①从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明最好。

②以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率最高。

③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小；后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用最适合标本要求的照明法进行观察。

必须指出，即使像反差最佳的UV激发暗场聚光器照明，由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此，必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片。