一、标本制作

可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法

1、直接法

（1）染色

切片固定后，滴加经稀释至染色效价为1∶8或1∶16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30分钟，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。

（2）洗片

倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS（磷酸盐缓冲液）中洗两次，搅拌，每次5分钟，再用蒸馏水洗1分钟，除去盐结晶。

（3）用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检。

（4）对照染色

• ①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。
• ②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。
• ③类属抗原染色试验，前面已作叙述。

直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。

2、间接法

（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30分钟。然后用0.01mol/l pH7.2PBS（磷酸盐缓冲液）洗两次，10分钟后吸去或吹干余留的液体。

（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30分钟，37℃。

（3）缓冲盐水洗两次10分钟，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

（4）对照染色

• ①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。
• ②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。
• ③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：

（1）片或涂片固定后，置于染色保湿盒内。

（2）滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30分钟。

（3）冲盐水洗2次，每次5分钟，吹干。

（4）加特异性荧光抗体在切片于37℃，30分钟。

（5）如（3）水洗。

（6）缓冲甘油封固，镜检。

间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

3、补体法

（1）材料

• ①免疫血清60℃灭活20分钟，用荧光抗体稀释液（Kolmers盐溶液）作2倍稀释，成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。
• ②补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐溶液稀释备用。Kolmers盐溶液配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
• ③抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐溶液稀释备用。

（2）方法步骤

• ①涂片或切片固定。
• ②吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30分钟，置于保持一定湿度的染色盒内。
• ③用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5分钟，吸干标本周围水液。
• ④滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体30分钟，37℃，水洗同（3）。
• ⑤蒸馏水洗1分钟，缓冲甘油封固。

（3）对照染色

• ①抗原对照。
• ②抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。
• ③灭活补体对照：将补体经56℃处理30分钟后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒及浓度较低的抗原物质时甚为理想。

4、膜抗原荧光抗体染色法

本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS（流式细胞）即采用此法原理。

5、双重染色法

在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC（荧光素）标记，B抗原的抗体用RB200（罗达明）标记，可采用以下染色方法：

（1）一步法双染色

先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。

（2）二步法双染色

先用RB200（罗达明）标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。

结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。

6、荧光抗体再染色法

若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又怀疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。

有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色（苏木精 — 伊红染色）标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法

某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少且昂贵，一般很少采用此法。