显微镜的七种观察方式

在光学显微镜的发展过程中,相差镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。

一、明视野观察(Bright field\BF)

明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式,广泛应用于病理检验,用于观察被染色切片,所有显微镜均能完成此功能。

 

二、暗视野观察(Dark field\DF)

暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同,不直接观察到照明的光线,而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此,视场成为黑暗的背景,而被检物体则呈现明亮的像。

暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象,微尘在强光直射通过的情况下,人眼不能观察,这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了体积,为人眼可见。

暗视野观察所需要的特殊附件暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体,而是将光线改变途径,使其斜射向被检物体,使照明光线不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图像暗视野观察的分辨率远高于明视野观察,最高达0.02—0.004。

 

三、相差镜检法(Phase contrast\PH)

光学显微镜的发展过程中,相差镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。

相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜

相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:

1.环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。

2.相位板(annular phaseplate):在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:

a. A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。

b. B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。

 

四、微分干涉镜检术(Differential interference contrast\DIC

微分干涉镜检术出现于60年代,它不仅能观察无色透明的物体,而且图像呈现出浮雕壮的立体感,并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点,观察效果更为逼真。

原理:微分干涉镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等,光束分别在距离很近的两点上通过被检物体,在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小,而不出现重影现象,使图像呈现出立体三维感觉。

 

五、偏光显微镜(Polarizing microscope\POL)

偏光显微镜鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色发来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜

偏光显微镜的特点,就是将普通改变为偏光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。

双折射性是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物,化学等领域。在生物学和植物学也有应用。

 

六、浮雕相衬显微镜(RC HMC)

1975年,由Robert Hoffman博士发明;2002年,专利到期,各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品。

1.原理:斜射光照射到标本产生折射、衍射,光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影,从而使透明标本表面产生明暗差异,增加观察对比度。

2.特点:

a.提高未染色标本的可见性和对比度;

b.图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕;

c.可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头);

d.可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织;

e.聚光镜的工作距离可以设计的更长;

f.RC物镜也可用于明场,暗场荧光观察。

 

七、荧光显微镜(Fluorescence Microscopy\FL)

荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。

1.优点:

a.检出能力高(放大作用);

b.对细胞的刺激小(可以活体染色);

c.能进行多重染色

2.用途:

a.物体构造的观察——荧光素;

b.荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等;

c.发荧光量的测定对物质定性、定量分析。

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